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华为四大名著:不同粒度的青稞粉中提取β一葡聚糖的工艺研究

来源:大话鹤壁   日期:2019-07-12

摘要:青稞属禾本科大麦属作物,由于它的籽实没有外壳,所以又称为裸大麦、米大麦、淮麦及元麦,主要分布在我国青海、西藏、四川的甘孜州、云南的迪庆、甘肃的甘南等地。青稞为海拔4200-4500m高寒地区唯一的农作物,具有高蛋白、高纤维、高维生素、低脂肪、低糖等特点,并富含微量元素、β -葡聚糖等营养成分。其中B-葡聚糖化学名称为(1-3)(1-4) -β -D-葡聚糖,是一类非淀粉多糖,分为水溶性和水不溶性两类。近年的研究发现,青稞中B-葡聚糖具有清肠、调节血糖、降低胆固醇、提高免疫力的功能,是对人体健康十分有益的一种可溶性膳食纤维。为合理利用青稞农作物,最大程度提取青稞中的β-葡聚糖,本文通过实验,采用万能粉碎机对青稞米进行粉碎,筛选不同目数的青稞粉,提取后通过比较β-葡聚糖的得率和提取量,从而确定最佳粒度。

关键词:青稞;β -葡聚糖;粒度;提取;分光光度法

为合理利用青稞农作物,最大程度提取青稞中的β一葡聚糖,对青稞米粉碎的粒度进行考察,确定最佳粉碎粒度,本文采取了以下实验方法:采用万能粉碎机对青稞米进行粉碎,筛选不同目数的青稞粉,提取后通过比较β一葡聚糖的得率和提取量,从而确定最佳粒度。结果表明:粉碎粒度为80目时,青稞β-葡聚糖的提取效果最好。最终得出结论:青稞米最佳粉碎粒度为80目时,能最大程度提取出青稞中的β-葡聚糖。

一、实验仪器、材料

AB135-S型电子天平(梅特勒一托利多公司);FS-30B型万能粉碎机(康华制药机械有限公司);药典筛(浙江上虞市五四纱筛厂);DZKW-D-I型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司);pH计(梅特勒一托利多仪器上海有限公司);旋转蒸发仪(EYELA东京理化器械株式会社);DZKW-S -8型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司);WH-90A型微型漩涡混合器(上海振荣科学仪器有限公司);TU-1901型紫外可见分光光度计(北京普析通用有限公司);15mL离心管、12mL比色管、移液枪(200μL和5mL);青稞米(青海);β-葡聚糖标准品(SIGMA公司,纯度>95%);混联β-葡聚糖检测试剂盒(Megazyme公司产品,货号K-BGLU);超纯水:公司超纯水系统生产;二水磷酸二氢钠、氢氧化钠、冰醋酸、乙醇、柠檬酸均为分析纯。

二、青稞原料中

β一葡聚糖含量检测方法学研究

试剂盒使用相关说明。Megazyme的β-葡聚糖测定试剂

盒可进行100次的测定试验,该试剂盒包含完整的测定方法及以下试剂,

瓶1:苔藓酶悬浮液(1mL,4℃条件下可保存3年以上),使用時用20mL的20mmol/L pH6.5磷酸缓冲溶液稀释瓶1中全部物质,可用聚丙烯管分装合适大小的几份后于-20℃条件下贮存,在取出使用期间需保持苔藓酶低温,在-20℃条件下可稳定保存两年以上。

瓶2:β一葡聚糖苷酶悬浮液(1mL,4℃条件下可保存3年以上),使用时用20mL的50mmol/L pH4.0的乙酸钠缓冲溶液稀释瓶2中全部物质,用聚丙烯管分装合适大小的几份后于-20℃条件下贮存,取出使用期间需保持苔藓酶低温,在-20℃条件下可稳定保存两年以上。注意:不要让苔藓酶和β -葡聚糖苷酶交叉污染。

瓶3:GOPOD试剂缓冲溶液(48mL,pH7.4,对羟基苯甲酸和0.4 %W/V叠氮化钠,4℃条件下可保存4年以上),使用时用IL蒸馏水稀释瓶3中全部的物质,立即使用。

瓶4:GOPOD试剂酶(葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4一氨基安替比林,为冻干粉,-20℃条件下可保存5年以上),使用时瓶3稀释后的1L溶液分次溶解瓶4中所有的物质,转移至试剂瓶,即为葡萄糖决定试剂GOPOD.用铝箔避光保存。在2-5℃条件下可稳定保存3个月,在-20℃条件下可稳定保存一年以上。

瓶5:D-葡萄糖标准溶液(5mL,1.Omg/mL,含0.2%的苯甲酸),在室温条件下可稳定保存五年以上。

瓶6:标准大麦样品,β一葡聚糖含量见小瓶上的标签,在室温条件下可稳定保存五年以上。

瓶7:标准燕麦样品,β一葡聚糖含量见小瓶上的标签,在室温条件下可稳定保存五年以上。

缓冲溶液的配制。磷酸缓冲溶液( 20mmol/L,pH6.5):溶解3.12g的二水磷酸二氢钠(NaH2P04‘2H20)到900mL的蒸馏水中,用lOOmmol/L的NaOH (4g/L)调节pH至6.5(加入约50mL能够达到要求),再加入蒸馏水配成IL的缓冲溶液。加入0.2g的叠氮化钠在4℃条件下可稳定保存2个月。

醋酸钠缓冲溶液( 50mmol/L,pH4.0):加入2.9mL的冰醋酸到900mL的蒸馏水中,用Imol/L的NaOH调节其pH到4.O,再用蒸馏水配成IL的缓冲溶液。加入0.2g的叠氮化钠在4℃条件下可稳定保存2个月。

醋酸钠缓冲溶液(200mmol/L,pH4.O):加入11.6mL的冰醋酸到900mL的蒸馏水中,用Imol/L的NaOH调节其pH至4.0,再加入蒸馏水配成IL的缓冲溶液。加入0.2g的叠氮化钠在4℃条件下可稳定保存2个月。注意:调节pH之前一定不能加叠氮化钠!酸性条件下叠氮化钠会放出毒气。

检测步骤。1.准确称取适量样品加入到15mL离心管中,确保全部样品都落到离心管底部。2.加入0.2mL的乙醇溶液( 50%,v/v)于离心管底部,旋涡混合器混匀,以辅助样品分散;再加入磷酸钠缓冲溶液(4.OmL,20mmol/L,pH6.5),用旋涡混合器把溶液混合均匀。3.混匀后,立即将离心管置于沸水浴中保温60秒;取出用旋涡混合器混合均匀后再放到100℃沸水浴中保温2分钟,并且再次混匀。4.在50℃的水浴中保温平衡5分钟。5.加入苔藓酶(0.2mL,IOU)并且振摇,密封离心管并且在50℃的水浴中保温1小时,保温期间在旋涡混合器上剧烈振荡3-4次。6.加入醋酸钠缓冲溶液(5.OmL,200mmol/L,pH4.0)并用旋涡混合器充分混合。7.待离心管冷却至室温(约需5分钟),离心分离(3000r/min,10分钟),小心准确地移取上清液0.1mL到三支试管的底部(12mL)。8.加入用50mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH4.O)配制的β -葡聚糖苷酶(O.lmL,0.2U)到其中的两个试管中(反应管),第三个试管中直接加入醋酸钠缓冲溶液(空白管),将所有的试管在50℃条件下保温10分钟。9.加入GOPOD试剂(3.OmL)到每一个试管,在50℃条件下进一步保温20分钟。10.在5lOnm处测定试管中的溶液吸光度值,在一个小时以内完成测定。11.每次实验必须设定空白对照和50μg/0.1ml或lOOμg/0. Iml葡萄糖标准,设定重复管。空白对照包括:0. ImL蒸馏水+O. ImL醋酸钠缓冲溶液+3.OmL GOPOD试剂。葡萄糖标准包括:0.1mL醋酸钠缓冲溶液+O.lmL D-葡萄糖标准(lOOμg/O.lmL)+3.OmLGOPOD试剂。12.每次测定必须包括一个标准大麦样品。

精密度试验。称取适量青稞原料粉末(过三号药典筛)以1.2.3方法处理并显色后,5lOnm重复测量6次,读取吸光度,计算RSD值为0.02%,相关数据见表1。

稳定性试验。用精密度试验样品在显色完成后分别过0、10、20、30、40、50、60分钟于5lOnm测定吸光度,计算吸光度的RSD值为0.17%,相关数据见表2。

重复性试验。称取青稞原料粉末(过三号药典筛)约80mg于15mL离心管底部,精密称定6份,按照1.2.3检测步骤处理样品并显色后于紫外可见分光光度计上5lOnm测定吸光度,计算得到该青稞原料β -葡聚糖平均含量为5.5553%,重复性试验的RSD值为1.26%,相关数据见表3。

加标回收试验。精密称取1.2.6重复性试验中取样量一半的青稞原料粉末,分别加入各自β一葡聚糖含量80%、100%、120%三个梯度的β一葡聚糖对照品各3份,按照1.2.3检测方法处理显色后于5lOnm读取吸光度,根据检测数据计算该方法检测青稞原料中β一葡聚糖含量的平均回收率97.28%,加标回收试验的RSD值为2.17%,相关数据见表4。

试验结论。精密度试验中青稞原料的RSD值为0.02%,表明检测结果的随机误差较小。稳定性试验青稞原料的RSD值为0.17%,表明该检测方法显色后在1小时内稳定性良好。该青稞原料中β-葡聚糖平均含量为5.5 553%,重复性试验的RSD值为1 .26%,表明检测结果重复性良好。青稞原料中β-葡聚糖对照品的回收率为94.37%-100.43%,平均值为97.28%,RSD值为2. 17%,表明該检测方法检测青稞原料及青稞提取物中β一葡聚糖含量准确可靠。

三、实验方法

青稞米的粉碎。将青稞米用万能粉碎机进行粉碎,通过不同目数编号(1—9号)的药典筛进行过筛处理,收集不同目数的青稞粉,备用。

青稞粉的提取。药材量:20g。提取条件:15倍量水,用浓盐酸调节ph至5,水浴锅加热至60℃下进行提取1次,2小时/次。过滤:用滤纸趁热过滤,收集滤液。浓缩干燥:65℃下减压浓缩青稞提取液,制备青稞提取物,称其重量,计算得率。检测:按照1.2中Megazyme公司混联β-葡聚糖检测试剂盒方法检测青稞提取物中β -葡聚糖的含量。

实验结果。不同编号对应的药典筛筛网目数得到的青稞粉,提取后得到的青稞提取物质量以及β-葡聚糖的含量结果如下表5。从表中可以看出粒度为80目时,青稞β-葡聚糖的提取量最大,β -葡聚糖的含量也最高。

实验讨论。不同粉碎粒度的青稞粉进行提取时,粉末越细,可提取出来的β -葡聚糖越多,但也并不是越细越好。因为粉末越细,提取时容易成糊糊状,提取并不能完全。以青稞β-葡聚糖最大提取量和最高含量为结果进行比较,确定青稞米的最佳粉碎粒度为80目。

四、结论

从实验结果来看,青稞米的最佳粉碎粒度为80目时,青稞β -葡聚糖的提取效果最好,提取量最大,其含量也最高。

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